Die Zeit des Nationalsozialismus war für Mainkofen das dunkelste Kapitel in seiner über 100-jährigen Geschichte. Der Erb- und Rassegedanke war Ausgangspunkt des völkisch-staatlichen Aufbaues im Nationalsozialismus. Staatlich sanktioniert, entschieden Erbgesundheit und Rassereinheit über eine Förderung der als „wertvoll“ Erachteten und führten im Falle von diagnostiziertem „unwertem Leben“ zur Diskriminierung, Verfolgung und Vernichtung unerwünschter Bevölkerungsgruppen. Hieraus entwickelten sich Forderungen, die Träger von angeblicher Minderwertigkeit an der Fortpflanzung zu hindern. Grundlage dafür war das „Gesetz zur Verhütung erbkranken Nachwuchses“, das am 01.01.1934 in Kraft trat. Bei den Sterilisationsaktivitäten gehörte Mainkofen sowohl absolut wie relativ zu den Spitzenreitern der bayerischen Anstalten. Von 1934 bis Ende 1943 wurden über 500 Erwachsene und Jugendliche beiderlei Geschlechts „zwangssterilisiert“. Dies geschah überwiegend im eigenen OP-Saal oder in umliegenden Krankenhäusern.

Mit Kriegsbeginn 1939 eskalierte diese menschenverachtende Weltanschauung mit der Freigabe der Vernichtung „lebensunwerten Lebens“. Eine unterstellte erbbiologische und gesellschaftliche „Minderwertigkeit“ prädestinierte dabei gerade Anstalts- und Heimbewohner in den Augen von Wissenschaftlern, Verwaltungs- und Medizinalbeamten zu Opfern eines staatlich inszenierten Massenmordes. Der Begriff, der diesen Vorgang verharmlosend umschreibt, heißt Euthanasie, oder wie es in der berüchtigten Ermächtigung Adolf Hitlers rückdatiert auf den 1. September 1939 ausgedrückt ist: „Gnadentod“.

Von Januar 1940 bis August 1941 wurde die sogenannte T4-Aktion (benannt nach der Zentrale in Berlin, Tiergartenstr. 4) durchgeführt, bei der in sechs eigens eingerichteten Gasmordanstalten mehr als 70.000 Patienten systematisch und zentral geplant, ermordet wurden. Die eigentliche, alle Patienten der Heil- und Pflegeanstalt Mainkofen umfassende Einbeziehung in die Aktion T 4 vollzog sich ab Sommer 1940.
Mittels Meldebögen wurden alle Patienten durch eine Kommission unter der Leitung des T4-Gutachters Dr. Theodor Steinmeyer erfasst, die ausgefüllten Bögen nach Berlin geschickt. Dort wurden sie Obergutachtern vorgelegt. Ein Zeichen in einem schwarzen Feld auf dem linken unteren Rand des Meldebogens entschied über Leben und Tod. Ein Rotes Kreuz bedeutete Tötung, ein blaues Überleben. In fünf Transporten wurden von Oktober 1940 bis Juli 1941 604 Patienten – darunter auch Kinder - vom Bahnhof Pankofen mit Schnellzugwägen der Deutschen Reichsbahn über die Heil- und Pflegeanstalt Niedernhart in die Tötungsanstalt Schloss Hartheim bei Linz verbracht. Durchgeführt wurden diese Transporte von der „gemeinnützigen Krankentransportgesellschaft (Gekrat)“. Ein weiterer Transport war für September 1941 geplant. Obwohl über die Tötungsaktionen als geheime Reichssache strenges Stillschweigen befohlen war, ließ sich der Zweck der Transporte nicht lange verheimlichen. Auf den Mitteilungen an die Angehörigen war angegeben, dass die Verstorbenen wegen Seuchengefahr verbrannt worden seien. Die genannten Todesursachen waren falsch. So wurde einer Frau mitgeteilt, dass ihr Mann an Blindarmentzündung gestorben sei, obwohl schon Jahre vorher der Blinddarm operativ entfernt worden war. Erst nach der berühmten Predigt des Münsteraner Bischofs Clemens August Graf von Galen am 03.08.1941 wurde die T4-Aktion von Hitler offiziell gestoppt.

Mit der Einstellung der Aktion T4 war der groß angelegte Versuch einer eugenischen Reinigung auf halbem Wege steckengeblieben. Eine Vielzahl von Pfleglingen, bereits durch die Meldebögen erfasst, nicht weniger lebenswert als die vorausgegangenen, war mit dem Leben davongekommen Nach über einem Jahr eugenischer Untätigkeit fand das bayerische Innenministerium am 30. November 1942 einen Ausweg, welcher die nicht zu verheimlichenden Tötungstransporte vermied und doch garantierte, dass wenigstens die Unproduktiven eliminiert werden konnten. Wenige Tage zuvor, am 17.11.1942 fand eine Besprechung der bayerischen Anstaltsdirektoren im bayerischen Innenministerium statt, an der auch der Direktor aus Mainkofen, Dr. Schapfl teilnahm.

Ein Teilnehmer berichtete nach 1945 den amerikanischen Ermittlungsbehörde u.a. Folgendes:
„Die Sitzung wurde sofort als Staatsgeheimnis erklärt. Der Vorsitzende erklärte, es stürben in den Anstalten noch viel zu wenig Kranke, es sei gar nicht notwendig, auftretende Krankheiten zu behandeln. Der Direktor der Anstalt Kaufbeuren hielt einen kurzen Vortrag in dem er bedauerte, dass die Euthanasie eingestellt worden sei. Er gehe jetzt so vor, dass er den Kranken, die sonst unter die Euthanasie gefallen wären, nur eine völlig fettlose Kost verabreichen ließe, er mache ausdrücklich auf fettlos aufmerksam. Innerhalb dreier Monate gingen die Kranken daraufhin durch Hungerödem ein. Er empfehle dieses Vorgehen allen Anstalten als Gebot der Stunde...“
Diese Empfehlung wurde am 30.11.1942 durch das Bayerische Innenministerium offiziell umgesetzt. Die ministerielle Anweisung hat als „Bayerischer Hungerkost-Erlass“ traurige Berühmtheit erlangt. Im Hinblick auf die kriegsbedingten Ernährungsverhältnisse und auf den Gesundheitszustand der arbeitenden Anstaltsinsassen - so heißt es dort - wird angeordnet, dass mit sofortiger Wirkung sowohl in quantitativer wie in qualitativer Hinsicht diejenigen Insassen, die nutzbringende Arbeit leisten oder in therapeutischer Behandlung stehen, ferner die noch bildungsfähigen Kinder, die Kriegsbeschädigten und die an Alterspsychose Leidenden zu Lasten der übrigen Insassen besser verpflegt werden.

Mainkofens Direktor Dr. Schapfl ordnete umgehend an, dass der Teil der Kranken, der nicht mehr „heilungsfähig“ war, eine schlechtere Kost als der Rest der Kranken erhalten solle. Der Hauptunterschied der Ernährungsform bestand darin, dass diese Fälle eine fleisch- und fettlose Kost bekamen und auch quantitativ vermindert versorgt wurden. Diese Ernährungsform wurde in Mainkofen als „3-b Kost“ bezeichnet. Auch die sonstigen Zustände in Mainkofen waren katastrophal. Es gab keine Wäsche, Kranke lagen völlig nackt in den Betten. Bettensäle waren nicht beheizt, die Kranken lagen auf den blanken Matratzen und froren fürchterlich. Drei Pfleglinge wurden in zwei Betten zusammengelegt, was dadurch geschah, dass man sie der Breite nach benutzte. Die Sterblichkeit in der Anstalt stieg sprunghaft an. Von 1943 bis 1945 starben 762 Patientinnen und Patienten an den Folgen der Hungerkost. Der katholische Anstaltspfarrer Kurat Müller, der im Mai 1945 von der amerikanischen Militärregierung als kommissarischer Direktor eingesetzt wurde berichtete nach dem Krieg: „Ich habe jeden Toten gesehen und möchte hier betonen, dass solche Skelette, wie ich unter den Toten der Anstalt gesehen habe, nur vom Hungertode herbeigeführt worden sein können.“

Als Todesursache wurden überwiegend Lungentuberkulose oder Darmkatarrh angegeben. Bereits 2011 hat der Bezirkstag von Niederbayern die Errichtung einer Gedenkstätte für die Opfer des Nationalsozialismus auf dem Gelände des ehemaligen Anstaltsfriedhofes beschlossen. Dabei sollen auch die über 1.300 Opfern der T4-Aktion und der Hungerkost auf Glasstelen namentlich genannt werden.